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细胞复苏方法

注意：收到的细胞如 24h 内复苏，可存放于-80℃冰箱；超过 24h 请存放于液氮中，复苏前 10min 取出，放于-80℃，让管中液氮挥发。
1．水浴锅 37℃预热；
2．适合该细胞系的完全培养基温浴到 37℃；
3．在 15mL 离心管中加入 6mL 完全培养基备用；
4．从-80℃冰箱中取出细胞，在 37℃水浴中轻轻转动冻存管，直到冻存管内仅剩余一小块冰芯，使细胞在 1min 内迅速解冻（水不能没过盖子或用封口膜把冻存管口封上）；
5．将冻存管转移到超净工作台内；打开盖子前，用 75％酒精擦拭冻存管外部；
6．用移液枪吸取细胞冻存悬液，转移至已预热的完全培养基的离心管内；
7．用 1mL 完全培养基洗涤冻存管 1 次，收集残留细胞，减少损失；
8． 细胞悬液以 1100rpm 离心 4min（离心速度和时间取决于细胞种类）
9．离心后，检查上清液是否清澈，有无完整的细胞沉淀；在无菌条件下，小心倒掉上清液，加入 1mL 完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀；
10．将细胞平均接种到 1 个 T25 培养瓶或底面积相当的培养容器中。加入足量完全培养基，1 个 T25 培养瓶中培养基总量不少于 6mL（实际培养瓶尺寸取决于冻存管冻存的细胞数量）；
11．摇匀细胞，放入 37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中（培养环境取决于细胞和培养基类型）；
12．复苏次日，观察细胞状态。
（1）贴壁细胞若细胞贴壁情况良好，可以更换新鲜的完全培养基；若观察到细胞呈圆亮形态但不贴壁，可以让细胞继续培养 24h 后再进行换液操作。之后，根据细胞的生长状况，每2-3 天更换一次完全培养基，观察细胞，生长至 80％以上的汇合度，即需传代。若细胞生长较慢或汇合度较低时，可以减少换液次数。
（2）悬浮细胞复苏后尽量放在相对小一些的容器中，使用含 20％血清的培养基复苏。悬浮细胞若细胞状态良好，可以更换新鲜的完全培养基；若细胞状态差且呈现灰度，可以继续培养 72h 后再观察细胞。观察发现有活细胞，可进行换液操作，观察细胞无明显变化，及时反馈本公司售后。

细胞传代方法

1.使用显微镜观察细胞，以评估融合程度并确认不存在细菌和真菌污染物。第一时间轻轻敲击培养瓶，这样可以将细胞从培养瓶壁脱落，避免在胰蛋白酶消化过程中，由于相关洗涤而使一些细胞会损失。
2.将含有细胞的培养基转移到无菌离心管中。
3.用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤任何剩余的贴壁细胞，转移洗涤液至无菌离心管中。
4.将1ml/25cm2表面积的胰蛋白酶/EDTA滴到细胞单层上。旋转培养瓶，使胰蛋白酶覆盖所有细胞。
5.将培养瓶放回培养箱中，静置2-10分钟。
6.使用倒置显微镜检查细胞，以确保所有细胞分离并漂浮。可以轻轻拍打培养瓶的侧面，使剩余的附着细胞脱落。
7.将细胞转移到含有保留的培养基和细胞的离心管中。
8.将整个细胞悬浮液以150 x g离心5分钟。
9.取出上清液，将细胞沉淀重新悬浮。并计数。
10.用移液管将所需数量的细胞移到新的培养瓶中，并使用完全培养基稀释至所需体积。
11.根据需要，每2-3天重复一次此过程。

储存条件

液氮保存