CRISPR–Csm：单分子水平实时追踪活细胞内RNA动态

【文献解读】CRISPR–Csm：单分子水平实时追踪活细胞内RNA动态

RNA作为蛋白质合成和基因表达调控的核心介质，其时空动态分布对于解析细胞功能至关重要。然而，现有成像技术面临显著瓶颈：外源标记干扰天然生理状态，重复序列依赖导致低丰度RNA检测盲区，单分子追踪精度不足等问题长期制约研究进展。针对这一技术空白，Chenglong Xia团队在《Nature Biotechnology》发布创新性解决方案——smLiveFISH。

该技术顺利获得整合CRISPR-Csm复合物的精准靶向能力与多重crRNA信号放大策略，首次实现了未修饰内源性单分子RNA的活细胞实时成像。相较于传统方法，smLiveFISH展现出三大革新优势：

① 非侵入式原位检测保留RNA天然状态；

② 突破低丰度RNA可视化极限；

③ 在神经元等原代细胞中仍保持高灵敏度。此项技术为RNA动态调控研究给予了前所未有的观测工具。

一、CRISPR–Csm复合物结合多重crRNA精准标记目标RNA

研究团队选用III-A型CRISPR–Csm系统作为核心工具，凭借其对RNA的高度特异性识别能力，实现单分子水平的RNA成像。实验中，他们第一时间构建了编码Csm复合物和CRISPR引导阵列的质粒。Csm复合物由Csm1、Csm2、dCsm3-2×GFP（失活的Csm3与双绿色荧光蛋白融合）、Csm4、Csm5及Cas6等蛋白亚基组成。其中，Cas6负责加工前体crRNA（pre-crRNA），生成成熟的crRNA并与Csm复合物组装成核糖核蛋白（RNP）复合物。为了提高成像信号，研究者设计了多重crRNA，使得多个Csm复合物能够沿目标RNA分子“铺排”，从而显著增强信噪比，确保了单分子分辨率。

在实验过程中，研究者选择了NOTCH2和MAP1B两种mRNA作为验证靶点。NOTCH2 mRNA因其在内质网附近富集，适合用于探究共翻译易位机制；MAP1B mRNA则与轴突生长相关，其在细胞边缘的富集使其成为研究定向运输的理想模型。研究团队分别为这两种mRNA设计了48条互补crRNA，并顺利获得瞬时转染的方式将质粒导入细胞。转染48小时后，利用荧光显微镜对细胞进行实时成像，成功观测到单个RNA分子的动态行为。

用smLiveFISH成像天然单个mRNA分子

二、揭示mRNA动态机制

研究团队采用单分子位移与扩散映射（SMdM）分析方法，深入剖析了NOTCH2和MAP1B mRNA的动态特性。在U2OS细胞中，NOTCH2 mRNA呈现出两种截然不同的动态群体：一类在内质网附近几乎静止，另一类则快速移动。为探究这一现象背后的潜在机制，研究者借助嘌呤霉素（puromycin）抑制翻译延伸，结果显示，静止的NOTCH2 mRNA群体显著减少，这表明其锚定在内质网的过程依赖于共翻译易位机制。

分析NOTCH2 mRNA的两种动态群体，静止的NOTCH2 mRNA在内质网上的锚定机制，以及嘌呤霉素处理后动态群体的变化

与之相比，MAP1B mRNA表现出明显的定向运输行为，它沿着微管结构向细胞边缘移动。顺利获得轨迹追踪和运动学分析，研究者发现MAP1B mRNA在运动过程中存在短暂停顿现象，推测这可能与分子马达蛋白（如驱动蛋白kinesin-1）的瞬时结合和释放有关。更为重要的是，经嘌呤霉素处理后，MAP1B mRNA的运动模式并未发生显著改变，这表明其运输过程独立于翻译。

解析MAP1B mRNA的定向运输现象，顺利获得轨迹追踪和运动学分析揭示其沿微管向细胞边缘移动的机制

此外，研究团队利用P小体（P-bodies）标志物DCP1A进行了共定位实验，结果发现，经嘌呤霉素处理后，部分MAP1B mRNA聚集成更大的颗粒，且与P小体显著共定位，这提示其可能参与了mRNA的降解或储存过程。顺利获得对单分子运动轨迹的进一步分析，研究者揭示了MAP1B mRNA在细胞内由微管驱动的定向运输机制，并首次在活细胞中实现了对该过程的实时可视化。

嘌呤霉素处理后MAP1B mRNA与P小体（P-bodies）的共定位实验，展示MAP1B mRNA在P小体形成过程中的作用

综上所述，这项研究提出的smLiveFISH技术，成功克服了传统RNA成像方法的缺陷，在不改变目标RNA稳定性和翻译的前提下，实现了对单分子未修饰RNA的动态行为进行追踪，更为重要的是，该技术为探究健康与疾病状态下RNA的时空分布规律给予了强有力的工具。CRISPR技术凭借其高度的靶向特异性与可编程特性，为RNA成像技术带来了革命性的突破，这使得研究者能够精确锁定感兴趣的转录本，进而实现无干扰的动态监测。

同时，CRISPR–Csm系统所采用的多重crRNA设计，极大层度提高了信噪比，即便是低丰度的内源RNA也能够被可靠地检测出啦。未来，这项技术有望在神经生物学、癌症研究及其他RNA相关疾病领域进一步拓展应用，它将助力科研家深入揭示细胞内RNA动态调控的奥秘，为RNA靶向治疗和分子诊断开辟新的思路，给予全新的工具。

论文来源：《Nature Biotechnology》

论文标题：Single-molecule live-cell RNA imaging with CRISPR–Csm

论文链接：http://doi.org/10.1038/s41587-024-02540-5

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